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半岛体育官方鉴于收集药理学和份子连接切磋鸦胆量医治结直肠癌的感化体制
结直肠癌（ cocontentctal crappercer ， CRC ）是消化零碎多见的恶性肿瘤之一，是环球癌症灭亡率的第 2 大缘由 [1] 。大多半 CRC 是披发的，遗传及情况身分是其关键的致病身分 [2] 。化疗是 CRC 的关头医治规划之一 [3] 。古代中药制剂行为癌症化疗的辅佐医治已在全天下规模内被普遍承受 [4] 。大宗研讨及临床实验向肿瘤的归纳医治不停拓展，已证实古代中药行为辅佐疗法，与化疗或放疗相联合，可能进步疗效、削减不良反映 [5⑺] 。
鸦胆量 doca jacamperica (L.) Mmove. 是原生于我国西北部及其余寒带、带地域的苦木科灌木。以鸦胆量果实为质料出产的中药抗肿瘤打针液，已普遍在临床被用于肺癌、肺癌脑变化和胃肠道肿瘤的辅佐医治。临床研讨证实鸦胆量可能加强临床上早期非小细胞肺癌的疗效并下降化疗的不良反映 [8*] 。鸦胆量苦醇是鸦胆量的主要活性成份 [10] 。研讨觉察，鸦胆量苦醇对乳腺癌、鼻咽癌、肺癌和其余恶性肿瘤均有按捺感化 [11*] 。鸦胆量果实的乙醇索取物大概经过宣布上调 p53 和按捺核因子 -κB （ thermonuclear bourgeois-κB ， NF-κB ）抗人结肠癌 HCT116 细胞发展 [15] 。 但是，其潜伏体制尚不清晰。
收集药理学是一种联合计较机迷信与医学来论述药物对疾病感化体制的新兴方式，能零碎地研讨、判定中药配方的生物活性化合物并可视化其多靶点、多路子的感化体制，已被普遍利用于展望、剖析中药的药理感化及潜伏体制 [4,16⑴7] 。是以，本研讨从收集药理学角度挑选鸦胆量的活性成份及针对 CRC 的靶点和旌旗灯号通路。份子连接是研讨小份子药物与靶点卵白受体之间的彼此感化及亲和力的摹拟计较方式。份子连接可能行为收集药理学的进一步考证，两者互补地用于中药研讨 [18] 。本研讨经过份子连接摹拟鸦胆量已判定组分宁可大概靶标卵白的份子彼此感化并计较联合力。鸦胆量苦醇行为被考证的鸦胆量抗肿瘤活性成份 [10] ，本研讨进一步在裸鼠荷瘤模子中考证其抗 CRC 的后劲及收集药理学展望的效力体制。
12 只 SPF 级雌性 BALB/c-Nu 小鼠， 6 周龄，体品质 16 ～ 20 g ，购自北京华阜康生物科技股分无限公司，品质及格证编号 No.262 ，品质赞助证号 SCXK （京） 2019-0008 ，植物利用赞助证号 SYXK （吉） 2018-0001 。植物于绝对湿度 45% ～ 55% 、温度（ 22 ± 1 ）℃、 12 h 光暗轮回的情况下，顺应性豢养 1 周，自在进食饮水。植物尝试经吉林大学根底学院伦理委员会核准（核准号 202073 ）。
ChemiSmanage 6000 Touch 型凝胶成像仪（上海勤翔迷信仪器无限公司）； SC⑷12 型 4 ℃立式冷藏柜（青岛市海尔股分无限公司）； PowerPac3000 型电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）； MOV*2F 型细胞培育箱（日本三洋公司）； V18R 型高速冷冻离心计心情（瑞士 Dynaisinglass 公司）； BETS**0 型摇床振动器（海门市其林贝尔公司）； Hemo 3600V 型 Shinova 血液学剖析仪（上海麦本养息科技无限公司）。
2.1.1 鸦胆量的活性成份及靶点 使用西医零碎药理学数据库（ TCMSP ， ）、西医药材料库（ ）和文件检索的方式搜集鸦胆量的首要活性成份，将能在 PubChem 中检索对应的 CAS 号和 SMILES 号的成份停止搜集。同时，对搜集的成份停止药动学消息检索，以口服生物利费用（ test bio女伶aiworkility ， OB ） ≥ 30% 、类药性（ dcarpeting-sameground ， DL ）≥ 0.18 为挑选前提。
2.1.2 CRC 的靶点及着急靶点的获得 在 GeneCards （ ）中，以“ CRC ”为检索词，物种限制为“ Homo mugginsiens ”，对其停止正文和展望。搜集相干性值大于 1 的靶点行为疾病靶点。在 logistician 2.1.0 制图平台（ ）绘制 CRC 与鸦胆量的着急靶点。
2.1.3 “活性成份 -CRC ”收集的建立 经过 Cytostem 3.7.2 （ ）可视化“活性成份 -CRC ”收集，毗连的节点越麋集，受该成份调控的靶点越多，解释该成份是鸦胆量抗 CRC 的主要活性成份。
2.1.4 卵白质 - 卵白质彼此感化（ pmemorisationin-pmemorisationin intepochction ， PPI ）收集的建立及关头靶点挑选 将 CRC 靶点导入 STRING 11.0 数据库（ ）停止剖析，形式设备为 “ 多种卵白 ” ，物种限制为“ Homo mugginsiens ”。预读数据后，其它卵白的相信度≥ 0.99 ，宁可余卵白无关连的卵白被埋没。尔后建立 PPI 收集，分数设备为 0.4 ，剔除不契合得分的靶标。使用 Barstrategy 画图函数，对卵白质毗连节点的个数停止手艺并绘制直方图，寻觅焦点靶点。
2.1.5 基因本质（ factor ontoindexy ， GO ）功效及都门基因与基因组百科全书（ metropolis encycgaitdia of factors and infoomes ， KEGG ）通路富集剖析 使用 R 3.6.0 工具软件停止 GO 功效富集剖析，从靶细胞的份子功效、细胞成份和生物进程肯定基因富集的功效， P 值与富集水平呈正相干。用 R 将后果绘制成响应的直方图和蔼泡图，拔取挑选校订后 P ＜ 0.05 的富集后果。使用 KEGG 路子富集剖析取得关键靶点感化的路子。
2.1.6 份子连接 将小份子药物的 mol2 花式的文献导入 AutoDockTools （ Version 1.5.7 ），对小份子药物停止均衡电荷、将非极性氢原子与绝对应的碳原子归并等润色取得 3D 构造，尔后转变为 PDBQT 花式的文献。从卵白质数据库（ ， Pmemorisationin Data Bank ， PDB ）获得 EGFR （ ID ： 1M17 ）、 Cahotelse* （ ID ： 4QUB ）、 Cyclin D1 （ ID ： 5VZU ）的晶体构造。经过 AutoDockTools 对受体卵白停止去水、加氢、均衡电荷等预处置后转变为 PDBQT 花式的文献。使用 AutoDockTools 对小份子药物和配体卵白停止份子连接，将受体和配体的 PDBQT 文献导入 AutoDockTools ，建立连接口袋。在大份子上设备中间，并设备 X 、 Y 和 Z 的参数以包管卵白质完整被笼盖。将输入的最大联合形式数设备为 20 。份子连接先天后天生活性位点身分，并计较联合能和氢键数。联合能为负值申明小份子药物配体可能与受体靶点卵白自觉联合，联合能越故事明联合越不变，联合能＜ −17.782 kJ/mol 即为能较好联合。用 Oenclosurezikkurat 将连接好的文献变换为 PDB 花式，经过 PyMOL （ 3D ， Version 2.2.0 ）和 LigPaggregation （ 2D ）对偶联模子停止可视化，并展现氢键，这 2 种模子都被普遍利用于可视化连接后果，包罗配体与卵白质主链或侧链元件之间的连接位点和氢键彼此感化形式。
2.2.2 植物模子的制备 BALB/c-Nu 小鼠右背侧 sc 100 μL HCT116 细胞（ 2 × 106 个 ），待肿瘤发展体积为 80 ～ 100 妹妹3 ， 小鼠随机分为对比组和鸦胆量苦醇（ 2 mg/kg ）组，每组 6 只。鸦胆量苦醇溶于 1% DMSO 和 20% β- 环糊精中，给药组 ip 药物，对比组 ip 等体积的 DMSO 和 β- 环糊精，每隔 1 d 给药 1 次。每隔 1 d 记实肿瘤巨细和小鼠体品质，当肿瘤巨细到达 2000 妹妹3 时，采取颈椎脱位法正法小鼠，搜集肿瘤，丈量肿瘤体积和品质，收集小鼠眶后静脉窦全血。
3.1.1 鸦胆量活性成份及对应靶点的获得 经过 TCMSP 检索共取得 67 个活性成份，以 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 行为弥补前提挑选，共取得 15 个鸦胆量首要活性成份（表 1 ）。搜集活性成份对应的靶点，去除反复值后共取得 34 个靶点。
3.1.3 “活性成份 -CRC ”收集的建立 经过 Cytostem 3.7.2 可视化“活性成份 -CRC ”收集（图 2 ），包罗 37 个节点和 97 个毗连。椭圆节点透露表现靶点，方框节点透露表现活性成份，灰色线透露表现节点间彼此感化。
3.1.4 PPI 收集剖析 将 32 个鸦胆量与 CRC 着急靶点输出 STRING ，建立 PPI 收集（图 3 ），共取得 32 个节点和 152 条节点之间的连线。节点是鸦胆量与 CRC 着急靶点编码的卵白，节点的连线越多，透露表现彼此感化越多，靶点的感化越主要。按照节点的连线数目，经过 Barstrategy 计较并统计前 30 个靶点（图 4 ），前 3 名为 EGFR 、 Cahotelse* 和 cyclin D1 。
3.1.5 GO 功效和 KEGG 通路富集剖析 如图 5 所示，鸦胆量医治 CRC 首要触及细胞凋亡、自噬、基因表白负调控、卵白磷酸化和卵白联合、转录因子联合等，首要感化于 PI3K/Akt 旌旗灯号通路、肿瘤坏死因子（ growth death bourgeois ， cytokine ）旌旗灯号通路和 p53 旌旗灯号通路等。
3.2.1 鸦胆量苦醇对荷瘤裸鼠模子肿瘤发展的作用 如图 8 所示，与对比组比力，鸦胆量苦醇组裸鼠肿瘤发展速率被较着按捺（ P ＜ 0.01 ），证实了鸦胆量苦醇对 CRC 拥有较着的按捺感化。
3.2.3 鸦胆量苦醇对荷瘤裸鼠生物平安性 评估 为研讨鸦胆量苦醇对荷瘤裸鼠代谢器官的作用，检测对比组和鸦胆量苦醇组荷瘤裸鼠的肝功效目标（ ALT 、 AST 、 ALB 、 γ-GT 、 T-BIL ）及肾功效目标（ BUN 、 CREA 、 UA ）和血通例目标（ WBC 、 corpuscle 、 PLT 、 HGB ），如图 10 所示，与对比组比力，鸦胆量苦醇组荷瘤裸鼠肝、肾功效和血通例目标均无昭著差别。
本研讨经过收集药理学剖析鸦胆量的首要活性成份及其抗 CRC 的潜伏体制，共取得鸦胆量苦醇、木樨草素、鸦胆量苷 B 、 β- 谷甾醇 4 个小份子药物活性成份和 EGFR 、 Cahotelse* 、 cyclin D1 等 32 个焦点靶点。 KEGG 通路富集剖析解释鸦胆量按捺 CRC 大概与 PI3K/Akt 通路、 cytokine 旌旗灯号通路和 p53 旌旗灯号通路等相干。在 4 个活性成份中，鸦胆量苦醇和木樨草素对应的靶点较着多于鸦胆量苷 B 和 β- 谷甾醇。将收集药理学展望的焦点成份鸦胆量苦醇及木樨草素与关头靶点卵白停止份子连接， 2 个焦点成份与 EGFR 、 Cahotelse* 和 cyclin D1 卵白的活性联合位点的联合能均小于 −16.736 kJ/mol ，解释焦点成份与关头的靶点卵白之间可能自觉联合且拥有较强的联合活性。在挑选的 4 种鸦胆量活性成份中，鸦胆量苦醇和木樨草素都可与 EGFR 彼此感化， EGFR 是多种靶向药物的医治靶点，如吉非替尼和厄洛替尼用于医治非小细胞肺癌，拉帕替尼用于医治早期或变化性乳腺癌 [19] 。本研讨觉察，木樨草素与 EGFR 的 Lys721 、 Glu738 、 Ala731 构成 3 个氢键，鸦胆量苦醇与 EGFR 的 Ile917 构成 1 个氢键。木樨草素和鸦胆量苦醇对 EGFR 的亲和力解释木樨草素 -EGFR 、鸦胆量苦醇 -EGFR 彼此感化的有用性。
鸦胆量苦醇是鸦胆量的首要活性成份。已有研讨表明，鸦胆量苦醇可能阻断 PI3K/Akt 通路的旌旗灯号传导，按捺胃癌等多种癌症的产生成长 [20] 。收集药理学剖析后果解释，鸦胆量苦醇可经过 EGFR/PI3K/ Akt 通路抗 CRC 。进一步经过 Wedemanding baggregationsound 尝试考证了鸦胆量苦醇可使该级联通路较着失活进而到达按捺 CRC ，考证了收集药理学展望后果。本研讨经过建立裸鼠移植瘤模子，研讨了鸦胆量苦醇对 CRC 的医治感化。鸦胆量苦醇较着按捺荷瘤裸鼠模子体内肿瘤的发展，同时与代谢相干的肝脏功效和肾脏功效未遭到较着的作用，血通例目标也不察看到昭著差别半岛体育官方。解释鸦胆量苦醇拥有很好的按捺 CRC 肿瘤细胞发展的感化。细胞周期与肿瘤的成长紧密亲密相干，首要由 G1/G0 和 G2/M 期构成，由 cyclin/CDK 复合物和 CDK 调和。研讨解释，鸦胆量苦醇经过感化于 CDK4 和 cyclin D1 调理非小细胞肺癌的 G1/G0 期， cyclin D1 表白的下降致使 G1/G0 期细胞的妨碍 [21] ，与本研讨的后果分歧，解释鸦胆量苦醇可以或许引诱肿瘤细胞的 G1/G0 期妨碍，进而按捺肿瘤细胞增殖。引诱细胞凋亡是按捺肿瘤成长的关头关节，受 Cahotelse 和 Bcl* 家眷卵白的调控， Bcl* 家眷卵白包罗促凋亡效力卵白如 Bax 和抗凋亡效力卵白如 Bcl* 。促凋亡效力卵白在凋亡应激源的感化下致使线粒体外膜通透化，开释细胞色素 C 来切割 Cahotelse* ，进而致使弗成逆的细胞凋亡。鸦胆量苦醇可经过宣布上调 cleafy Cahotelse* 表白和 Bax/Bcl* 值，增进多种肿瘤细胞凋亡 [22] ，与本研讨后果分歧，解释鸦胆量苦醇可引诱肿瘤细胞凋亡，大概触及线粒体凋亡路子。肿瘤变化是肿瘤患者灭亡的相干身分。细胞外基质被 MMP 润色和降解，进而致使肿瘤细胞的分手和迁徙。本研讨觉察，鸦胆量苦醇可以或许下降肿瘤结构中 MMP7 和 MMP9 的表白，拥有按捺肿瘤细胞进犯和迁徙的才能，与鸦胆量苦醇对胃癌 SGC⑺901 细胞的感化分歧 [19] 。
药物的堆集和消灭大概侵害器官。是以，经过对小鼠的血液生化目标来评价鸦胆量苦醇是不是拥有潜伏的毒性感化。后果显现，肝、肾功效和血通例目标未见药物引发的昭著性差别。是以，鸦胆量苦醇是一种平安、有用、有远景的抗肿瘤佐剂。但是，本研讨有几个限定性： ① 来安闲线数据库的消息是鉴于检查和展望的数据，是以，未经表明和未记实的化合物或靶点大概未被加入本研讨中； ② 今朝对鸦胆量 15 种化合物的定额测定研讨尚不完整，是以，将来应停止体例肯定的研讨； ③ 鸦胆量苦醇固然为鸦胆量抗 CRC 的最关键的生物活性成份，但不克不及完整代表鸦胆量，是以，必要进一步的研讨来摸索鸦胆量体表里医治 CRC 的潜伏份子体制。
本研讨先经过收集药理学阐了然鸦胆量抗 CRC 最关键的 4 个生物活性成份（鸦胆量苦醇、木樨草素、鸦胆量苷 B 、 β- 谷甾醇）和 3 个主要靶点（ EGFR 、 Cahotelse* 、 cyclin D1 ），首要感化于 EGFR/ PI3K/Akt 旌旗灯号通路；经过份子连接手艺考证了活性成份与靶点的联合才能，觉察鸦胆量苦醇是鸦胆量抗 CRC 的关头成份；体内尝试进一步证实了鸦胆量苦醇抗 CRC 的感化及份子体制，为鸦胆量医治 CRC 供给了尝试根据，并为从中药中探讨活性成份、焦点靶点和潜伏体制供给了方式。
来 源：赵韦欣，王 晴，王梦齐，季安璇，郑明朗，赵淑华． 鉴于收集药理学和份子连接切磋鸦胆量医治结直肠癌的感化体制[J]. 中草药, 2023, 54(6):1850⑴859.
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