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半岛体育官方鉴于收集药理学及体外尝试研讨弓足花黄酮按捺肺纤维化的体制
肺纤维化是一种多见的临床多见的耐性、停止性、弗成逆性间质性肺疾病，病理上显示为大度间质细胞增生及细胞外基质堆积 [1] 。确诊后，肺纤维化患者的 5 年均匀保存率仅为 20% ～ 30% ，乃至低于某些癌症的保存率 [2] 。我国肺纤维化患者约 60 万人，环球约为 300 万人，并且其病发率还没有获得有用掌握，今朝对大多半间质性肺疾病的医治手腕极其无限，可用药物希少。环球规模内，医治肺纤维化的主宰药物为吡菲尼酮和尼达尼布，颠末临床考证，两者不妨有用按捺特发性肺纤维化，但潜伏胃肠道反映、肝毁伤、出血及不耐受等不良反映，并且在多种纤维化肺疾病中其实不克不及耽误患者寿命。据临床评价，这些药物不妨有用按捺特发性肺纤维化，但它们有胃肠道反映、肝毁伤和出血等潜伏的不良反映 [3] 。与此同时，受新式冠状病毒的感化，肺纤维化潜伏风险加重。《新冠肺炎确诊 1 年后的后遗症评价》中指出，在治愈后的患者中，最多见的肺部后遗症是肺部结节、肺部暗影、肺部纤维化和支气管的扩大 [4] 。思索到肺纤维化是感化民众安康的匆忙题目，是以十分需求开辟平安、有用的可用于医治肺纤维化疾病的药物。
弓足花为毛茛科弓足花属花草弓足花 Tlistingius lineamentensis Bge. 的枯燥花，始见于《本草原则拣到》，拥有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理感化 [5⑹] 。对肺纤维化的感化体制研讨中证据氧化应激发到关头感化，而黄酮类成份拥有较好的抗氧化活性。问题组后期研讨证据弓足花黄酮不妨有用按捺 PM2.5 引诱的大鼠肺纤维化 [7] ，但其详细感化体制其实不清晰。收集药理学的团体性、体系性的特性与中药团体观、辨证论治的特性符合，为中药的药理研讨供给了新的思绪，为中中医临床前研讨之间的联合缔造了一种可行路子 [8] 。本研讨经过收集药理学方式，研讨弓足花黄酮按捺肺纤维化的感化体制，使用体外细胞尝试对挑选出的潜伏感化靶点停止考证，旨在提醒弓足花黄酮按捺肺纤维化的感化体制。
弓足花采摘于宁夏银川地域，由宁夏农林迷信院供给，经宁夏农林迷信院郭生虎传授判定为毛茛科花草弓足花 T . lineamentensis Bge. 的枯燥花。
2.1.1 药物成份及靶点挑选 经过 TCMSP 数据库（ ） [9] ，以“弓足花”为正式替换词，以“口服生物利费用（ test bio女伶aiworkility ， OB ）≥ 30% ”“类药性（ dcarpeting-sameground ， DL ）≥ 0.18 ”为挑选前提，取得活性成份和靶点音讯，挑选此中黄酮的成份 [10] 。 使用 Ucutdeteriorate 数据库（ ）停止卵白称呼和基因称呼的更动 [11] 。
2.1.2 弓足花黄酮“活性成份 - 靶点”收集的建立 将挑选后的弓足花成份停止挑选，讨取黄酮成份，划分将 2 个弓足花黄酮成份标识表记标帜为玄参黄酮和五羟黄酮，划分将 2 个黄酮各自对应的靶点停止汇总。随即，利用 Cytostem 3.9.1 使用的软件建立弓足花黄酮“活性成份 - 靶点”收集，停止可视化 [12] 。
2.1.3 肺纤维化疾病靶点获得 借助 GeneCards 和 Dcarpetingslope 数据库，以“ pulmonic taradiddlerosis ”为正式替换词， 挑选相干基因 [13] 。将各数据库挑选后的基因对应的靶点停止汇总、团体后与药物靶点归并，挑选反复靶点。
2.1.4 卵白质 - 卵白质彼此感化（pmemorisationin-pmemorisationin intepochction ，PPI ） 收集的建立及剖析 应用 logisticiany 插件，获得弓足花黄酮的药物靶点和肺纤维化靶点的 PPI 音讯，并获得其公有靶点。将公有靶点导入 Cytostem 3.9.1 使用的软件停止可视化剖析，并对公有靶点停止相干性剖析半岛体育官方，获得焦点靶点 [13] 。
取枯燥弓足花破坏，过筛，称取 100 g ，参加 10 倍量的 70% 乙醇溶液，加热回流讨取 2 h ，滤事后取滤液，减压稀释，得粗黄酮。按 1 ∶ 4 的料液比参加 95% 乙醇积淀，取滤液稀释，冷冻枯燥，得弓足花黄酮讨取物 [14] 。以芦丁为对比品，分光光度法测定弓足花讨取液中的总黄酮含量 [15] ，计较讨取率。
2.3.1 超氧阴离子自在基消灭才能测定 采取邻苯三酚比色法测定弓足花黄酮的超氧阴离子自在基消灭才能。向各试管中参加 0.1 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 4.5 mL ，后划分参加原料浓度为 10 、 20 、 50 、 100 、 250 、 500 、 1000 μg/mL 的弓足花黄酮溶液各 1 mL ，参加蒸馏水 2.4 mL ，摇匀后室温静置 3 min 后参加 10 妹妹ol/L 的邻苯三酚溶液 0.1 mL 停止反映，蒸馏水调零，在 325 nm 下测定其吸光度（ A ）值 [16] ，计较超氧阴离子自在基消灭率。
A 0 为水取代黄酮时测得的 A 值， A i 为差别原料浓度待测样板测得的 A 值， A j 为水取代邻苯三酚时差别原料浓度待测样板测得的本底 A 值
2.4.3 尝试分组 A549 细胞以 1 × 106 个 / 孔接种于 6 孔板，培育 24 h ，建树对比组（含有细胞培育液）、模子组（含有 10 ng/mL TGF-β 的细胞培育液）和差别原料浓度（ 200 、 400 、 600 μg/mL ）弓足花黄酮组（含 10 ng/mL TGF-β 和差别原料浓度药物的细胞培育液）。
2.4.4 上皮间充质转折标记物表示 搜集细胞，参加 RIPA 裂解液讨取卵白，冰上裂解 30 min 后， 4 ℃、 12 000 × g 离心 10 min ，取上清。利用 BCA 卵白浓度测定试剂盒测定卵白浓度后，参加上样缓冲液， 100 ℃煮沸 10 min 使卵白变性。卵白样板经12烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，参加 5% 脱脂牛奶，室温关闭 2 h 后，划分参加 E-cadherin 、 notchholdupen⑴ 、 α-SMA 、 Vimenkeep 和 β-ackeep 抗体， 4 ℃孵育留宿；洗濯后参加二抗，室温孵育 1 h ，参加 ECL 发光液显影，用 Ipublicatione J 使用的软件剖析条带灰度值 [19⑵0] 。
2.4.7 统计学剖析 数据利用Gpinkhaggrandize Prism 8.0 使用的软件处置，采取独身分方差剖析停止组间统计。
应用 Metastem 停止BP 、MF 、CC 富集剖析，显现潜伏感化靶点首要BP 会合在有机高分子材料物应激反映、氧化应激、活性氧等，MF 首要会合在细胞因子及其受体（图2-A ）。KEGG 富集剖析显现首要会合在癌症、脂质和动脉粥样由软变硬（图2-B ）。
弓足花经过 60% 乙醇讨取后，混有必定量多糖， 后经乙醇积淀，撤废多糖，纯化后冻干， 3 批次弓足花黄酮讨取率划分为 68.44% 、 71.24% 、 71.33% 。体外抗氧化活性尝试后果（图 3 ）显现，跟着弓足花黄酮原料浓度的降低，其抗氧化才能逐步加强。当原料浓度跨越 500 μg/mL 时，其超氧阴离子自在基消灭率到达 60% 以上，羟基自在基消灭率跨越 80% ，而 DPPH 自在基消灭率跨越 90% ，显示出杰出的抗氧化活性。
将弓足花黄酮感化于 A549 细胞，经过 CCK* 法尝试其生机，如图 4 所示， 100 ～ 800 μg/mL 弓足花黄酮对 A549 细胞活性无较着感化，申明在此原料浓度规模内并未显示出毒性感化。 A549 细胞颠末 TGF-β1 引诱后，赐与差别原料浓度弓足花黄酮停止干涉干与，显现 200 ～ 800 μg/mL 弓足花黄酮光鲜按捺 A549 细胞活性（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ），而 600 、 800 μg/mL 感化强度附近，筛选 200 、 400 、 600 μg/mL 举动弓足花黄酮后续尝试剂量。
如图6-A 所示，与对比组比力，模子组细胞中SOD 活性较着下降（P ＜0.05 ），MDA 程度较着降低（P ＜0.01 ）；与模子组比力，弓足花黄酮各剂量组SOD 活性较着降低（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ），600 μg/mL 弓足花黄酮组MDA 程度较着下降（P ＜0.05 ），解释弓足花黄酮不妨较着改良TGF-β1 引诱的氧化应激。ROS 检测后果（图6-B ）也证据了这一后果，模子组ROS 旌旗灯号强度较着加强（P ＜0.001 ），各给药组ROS 旌旗灯号强度组较着削弱（P ＜0.001 ）。Wedemanding baggregationsound 检测氧化应激相干卵白表示，如图6-C 所示，与对比组比力，模子组Keap1 卵白表示程度光鲜下降（P ＜0.001 ），Nrf2 卵白表示 程度降低，受Nrf2 调控的HO⑴ 和NQO⑴ 卵白表示程度均光鲜降低（P ＜0.001 ）；与模子组比力，400 、 600 μg/mL 弓足花黄酮组 Keap1 卵白表示程度进一步光鲜下降（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）， 200 、 600 μg/mL 弓足花黄酮组 Nrf2 卵白表示程度均进一步光鲜降低（ P ＜ 0.01 、 0.001 ），各给药组 HO⑴ 和 NQO⑴ 卵白表示程度均进一步光鲜降低（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）。
联合收集药理学靶点展望，随即对 Akt 及p-Akt 停止检测（图7 ）显现，与对比组比力，模子组p-Akt 卵白表示程度光鲜降低（P ＜0.001 ），申明Akt 被激活，弓足花黄酮则不妨按捺其激活（P ＜0.001 ）。随即在对纤维化典范旌旗灯号通路停止检测时显现，模子组p-Sangry2/3 、mTOR 及NF-κB 一样被激活（P ＜0.001 ），弓足花黄酮不妨按捺p-Sangry2/3 、mTOR 及NF-κB 激活（P ＜0.001 ）。
在平常环境下， Nrf2 位于胞质中，宁可特同性按捺性受体Keap1 联合，无活性且Keap1 可增进Nrf2 的泛素化降解进程，是以Nrf2 表示较低[22] 。但在氧化应激感化下，Nrf2 与Keap1 产生解偶联，变动入核，经过与小份子肌腱纤维瘤卵白异二聚体化，进而驱动，调控NQO1 、HO⑴ 等抗氧化酶基因的表示[23] 。Nrf2/Keap1 旌旗灯号通路对肺纤维化的感化愈来愈遭到存眷，研讨解释，Nrf2/Keap1 旌旗灯号通路再次上调HO⑴ 、NQO1 等抗氧化物的表示，调控体内氧化应激程度，下降肺纤维化感化历程，削减胶原的分解，庇护肺部构造，进步细胞抗性，按捺成纤维细胞转离散为肌成纤维细胞[24⑵5] 。
另外， 磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphaorderlinosetol 3-relationase ，PI3K ） /Akt 旌旗灯号通路被证据径直介入II 型肺泡上皮细胞的上皮间充质转折产生，增进肺纤维化成长[26] 。PI3K/Akt 旌旗灯号通路能使受体酪氨酸激酶活化，进而使细胞质上的PI3K 易位至细胞膜，经过调控下流mTOR 及ROS 等介入肺纤维化[27⑵8] 。另外，PI3K/Akt 旌旗灯号通路激活与NF-κB 旌旗灯号通路紧密亲密相干[29] 。NF-κB 在肺纤维化初期的高表示与PI3K/Akt 旌旗灯号通路激活相干，Akt 能经过磷酸化激活NF-κB 按捺因子（conqueror of NF-κB ，IκB ）激酶，致使IκB 与NF-κB 分手，激活NF-κB 旌旗灯号通路，引诱目标基因表示，发生炎症反映，加剧肺纤维化的历程[30] 。
本研讨起首借助收集药理学，剖析弓足花黄酮与肺纤维化的潜伏靶点，经过剖析挑选出弓足花黄酮感化肺纤维化的感化靶点，与此同时， KEGG 剖析显现弓足花黄酮感化肺纤维化最有大概的潜伏感化体制为氧化应激，潜伏感化靶点为AKT1 、cytokine 、TP53 、VEGFA 、IL⑹ 、IL⑴B 。随即，本研讨联合体外细胞模子停止考证。尝试后果显现，弓足花黄酮在体外拥有杰出的抗氧化感化，感化细胞有用原料浓度为200 、400 、600 μg/mL ，并且显现出原料浓度相干性，且不生涯细胞毒性。弓足花黄酮不妨有用按捺TGF-β1 引诱后上皮间充质转折标记物的表示。氧化应激检测也证据了弓足花黄酮拥有杰出的抗氧化感化，弓足花黄酮可以或许加强SOD 活性，下降MDA 程度，流式细胞仪检测ROS 表示后果显现，当细胞呈现上皮间充质转折时，ROS 表示较着加强，而弓足花黄酮不妨有用下降ROS 表示，申明弓足花黄酮不妨下降细胞内氧化应激程度。
在对氧化应激典范通路 Keap1/Nrf⑵ 旌旗灯号通路检测时显现，当细胞呈现上皮间充质转折时，两者停止解离，Keap1 表示逐步下降，Nrf2 逐步加强，受Nrf2 调控的HO⑴ 与NQO⑴ 表示也呈现差同性变革，申明弓足花黄酮不妨感化Keap1/Nrf2 旌旗灯号通路，发扬抗氧化感化，从而按捺上皮间充质转折，这与收集药理学展望潜伏感化体制绝对应。随即，在对潜伏感化靶点停止检测时显现Akt⑴ 显示出较着的差同性。而PI3K/Akt/mTOR 旌旗灯号通路与肺纤维化的产生与成长息息相干，随即对mTOR 的检测后果也证据了猜测。
本研讨后果证实弓足花黄酮拥有杰出的抗氧化活性，而且对 TGF-β1 引诱的A549 细胞上皮间充质转折拥有较着的按捺感化，其感化体制及感化靶点经过收集药理学停止考证，检测后果也考证了收集药理学的剖析后果。鉴于这一显现，在前期的尝试安排中将中心摸索弓足花黄酮在植物体内按捺肺纤维化的药效感化和其潜伏感化体制。本研讨不但为收集药理学在中药防治肺纤维化研讨中的需要性供给无力的证明，也为弓足花黄酮开辟供给了根底数据，与今生尝试手腕相联合，富厚了中药在临床上的利用大概性。
来 源：王家才，段星星，张 波，辛 杰，陈虞超，郭生虎，李新朋，王 振．鉴于收集药理学及体外尝试研讨弓足花黄酮按捺肺纤维化的体制 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2144⑵154.
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